熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h1>

時間：2015-3-2閱讀：4327

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1．熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建
靶基因3’UTR的獲得。3’UTR序列是指從Mrnaz終止密碼子后的*個堿基開始到mRNAzui后一個堿基（通常是polyA結(jié)尾）。模板可采用相應(yīng)物種的cDNA或基因組。在選擇模板時要注意：一般來講，cDNA適于所有的3’UTR擴(kuò)增，但有時3’端AT過多導(dǎo)致引物設(shè)計困難時，可以考慮用基因組做模板。但是基因組做模板的前提是靶基因3’UTR由一個外顯子組成。一般盡可能全面的擴(kuò)增3’UTR，但如果3’UTR過長或引物設(shè)計困難，可以選取包括miRNA結(jié)合位點的一段3’UTR。

2．熒光素報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
開始做報告基因?qū)嶒炃埃氵€需要準(zhǔn)備以下材料：
1）TK質(zhì)粒，作為共轉(zhuǎn)染的內(nèi)參。
2）miRNA的過表達(dá)質(zhì)粒或合成的miRNA。質(zhì)粒的濃度盡量在500ng/ul以上，合成的miRNA稀釋到20uM。
3）狀態(tài)良好的細(xì)胞。
常用24孔板進(jìn)行報告基因?qū)嶒灐７旨?xì)胞時保證細(xì)胞鋪板均勻（搖勻細(xì)胞的方法見細(xì)胞培養(yǎng)的方法），每孔細(xì)胞數(shù)目相當(dāng)。以293ET細(xì)胞為例，我們轉(zhuǎn)染的密度一般在60-80%作用，如果用威格拉斯轉(zhuǎn)染試劑，細(xì)胞密度可以稍高些，因為轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡較多。

轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染時必須配總體系再依次分成小體系。這一步?jīng)Q定著每個孔的平行性和實驗的可重復(fù)性。轉(zhuǎn)染核酸用量為每孔：luc-3’UTR 200ng；TK 50ng；miRNA-pcDNA3.1 1ug或合成的miRNA 2.5ul（終濃度100nM）。Vig每孔用量為1ul，lip2000為2ul。轉(zhuǎn)染后4-6h換液。如果用vig轉(zhuǎn)染必須及時換液，否則細(xì)胞會尸橫遍野。注意設(shè)立合理的對照，通常用pcDNA3.1（或miRNA NC）代替miRNA-pcDNA3.1（miRNA）做miRNA的對照。

收細(xì)胞
轉(zhuǎn)染24-48h可以收取細(xì)胞。用生理鹽水或PBS清洗細(xì)胞兩次，因293細(xì)胞極易脫落，建議操作溫柔，如果對自己的操作沒有自信，可以增大生理鹽水量只洗一次。之后吸干生理鹽水。每孔加入80ul 1Xpassive buffer（裂解液的量可視細(xì)胞數(shù)目稍作調(diào)整），室溫?fù)u20min，如果細(xì)胞裂解充分會看到白色粘稠狀細(xì)胞碎片。如果不馬上測，可連同24孔板凍于-80度，測時再取出解凍。-20度可保存一周。4度可保存一天。

3．測定熒光素酶活性

測定熒光素酶活性需使用質(zhì)量好的ELISA試劑盒，雙熒光素酶報告系統(tǒng)：bufferII為螢火蟲熒光素酶的底物，測量數(shù)值為我們的報告基因的活性；S&G buffer 作用是淬滅螢火蟲熒光素酶的活性并提供海腎熒光素酶反應(yīng)的緩沖環(huán)境，測定的數(shù)值為內(nèi)參的活性。測定時，取細(xì)胞裂解液8ul到96孔板中（的96孔板）上機(jī)測量。每種底物每孔加30ul。

4．結(jié)果分析
測定熒光素酶后會返回三個值：螢火蟲熒光素酶活性、海腎熒光素酶活性及兩者的比值。比值將作為zui后的分析數(shù)據(jù)，反映了該孔報告基因的相對活性。通常將對照歸一為1，實驗組與其相比取相對值。此相對值用于zui后作圖和統(tǒng)計分析。2.GFP報告基因?qū)嶒?/span>

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