間接法又稱為熒光抗-抗體法
? 需要兩種抗體參與，即一抗和二抗(熒光素標記)。一抗對標本中的抗原來說起抗體的作用，但對熒光標記的二抗來說又起著抗原作用。
–  可用來檢測標本中未知抗原，也可檢測血清中未知抗體。

?間接免疫熒光法操作步驟
?  標本的處理及非特異染色的封閉同直接法；
?  一抗染色：
–  加未標記的特異性抗體(通常1:100稀釋，用0.01MpH7.4的PBS稀釋)，37?C作用30min或4?C過夜。
?  0.01M PBST漂洗5min×3次(震蕩漂洗)；
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間接免疫熒光法操作步驟(續)
?   加熒光標記的二抗抗體，37?C濕盒避光作用30min。
?  0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上錫紙，在搖床上漂洗)；
?  甘油緩沖液封片
?  鏡檢

?  優點：敏感性較高，比直接法高10倍左右；制備一種熒光標記抗體，可應用于多種一抗；
?  缺點：是參加反應的因子較多，產生非特異性染色的機會增多。

?間接免疫熒光法的注意事項
?  熒光染色后一般在1h內完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長 ，會使熒光減弱。
?  每次試驗時 ，需設置以下三種對照：
–  陽性對照：陽性血清+熒光標記物
–  陰性對照：陰性血清+熒光標記物
–  熒光標記物對照：PBS+熒光標記物
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間接免疫熒光法的注意事項(續)

?  標本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。
?  一抗和二抗應始終保持在標本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。