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上海酶聯(lián)生物研究所
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閱讀：832發(fā)布時(shí)間：2011-12-07
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PCR技術(shù)（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是現(xiàn)代分子生物學(xué)的一個(gè)巨大突破，它能在體外迅速、大量、靈敏地?cái)U(kuò)增基因片段?？墒牵?jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增的大量相關(guān)基因片段如何能有效拼接，卻是一個(gè)很值行探討的問(wèn)題。傳統(tǒng)的方法是引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，這不但操作繁雜，而有時(shí)為了構(gòu)建限性位點(diǎn)還會(huì)影響解讀三聯(lián)密碼的正確性。本介紹兩種基因 拼接的新方法，即SOE和SDL法，就能巧妙地解決這個(gè)問(wèn)題。
SOE法
1989年，Horton等人提出了SOE法（Gene splicing by over lap extension），即通 過(guò)復(fù)制時(shí)DNA鏈的交錯(cuò)延伸不實(shí)現(xiàn)基因拼接。本法可分四步進(jìn)行。
（1）引物設(shè)計(jì)：引物a和d是常規(guī)引物；b的左半段為常規(guī)引物，右半段為基因Ⅱ的引 物序列；c同理；則b和c的部分堿基可互補(bǔ)配對(duì)。
（2）基因I、Ⅱ分別擴(kuò)增，產(chǎn)物相應(yīng)為片段A、B和C、D。
（3）兩種產(chǎn)物混合，經(jīng)變性及退火處理，A鏈和D鏈部分堿基互補(bǔ)配對(duì)，成雜交鏈。
（4）在DNApolymeraseI作用下，A和D鏈互為引物和模板，合成出A'D'鏈，即為基因I 和基因Ⅱ的接接產(chǎn)物。若在引物中引入突變的堿基序列，則在接接產(chǎn)物中，將按預(yù)先 設(shè)計(jì)要求出現(xiàn)定點(diǎn)突變。
SDL法
1991年下半年，Lebedenko等人提出SDL方法（Gene splicing by directed liga- tion），即直接拼接法，它在SOE法基礎(chǔ)上又有新的突破。本法的要點(diǎn)如下：
（1）限制性內(nèi)切酶， EcoRI核酸內(nèi)切酶（或其它Ⅱs類限制性內(nèi)切酶）能專一性識(shí)別 6bp的非回文序列，并能單向特異性地切斷EcoRI識(shí)別的6bp以外的1—5個(gè)核苷酸，產(chǎn)生一個(gè)以突出的4個(gè)核苷酸為結(jié)尾的5'末端。因而該伸頭末端與酶切位點(diǎn)序列無(wú)關(guān)， 而是由切點(diǎn)附近的序列決定的。
（2）擴(kuò)增時(shí)實(shí)際運(yùn)用的引物的構(gòu)建。以exon5的實(shí)用引物為例：5'鏈引物包括常規(guī)5' 鏈引物序列和BamHI識(shí)別位點(diǎn)及起密碼序列；3'鏈引物包括常規(guī)3'鏈引物和AC及EcoRI 識(shí)別位點(diǎn)。
（3）*性末端的形成。經(jīng)擴(kuò)增和限制性內(nèi)切酶處理后可得供拼接的exon5，它的右側(cè)突出末端TCAC中，TC為原始exon5的一部分，AC為原始exon6的一部分，且TCAC與 exon6的AGTG互補(bǔ)配對(duì)，其余類推。因?yàn)檫@種結(jié)尾相同的幾率為1/259，故可被視作 “*性末端”。
（4）把經(jīng)擴(kuò)增的exon5、exon6和exon7混合，依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，它們就能按順 序依次拼接。
顯而易見(jiàn)，在SOE法中，退火時(shí)的zui希望產(chǎn)物是AD，雜交鏈，但A鏈和B鏈，C鏈和D鏈配對(duì)的可能性更大，另外還有B、C鏈的配對(duì)，這些都是不利的；而SDL法中就不存在這個(gè)問(wèn)題。另一方面，由于不需DNApolymeraseI，避免了它在復(fù)制中可能帶來(lái)的錯(cuò) 誤，所以，SDL法更*。
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