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上海酶聯生物研究所
上海酶聯生物研究所
閱讀：895發布時間：2012-2-7
【原理】
考馬斯亮藍G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種?？捡R斯亮藍G－250在游離狀態下呈紅色，在稀酸溶液中，當它與蛋白質的疏水區結合后變為青色，前者zui大光吸收在465nM，后者在595nM。在一定蛋白質濃度范圍內(1～100μg)，蛋白質與色素結合物在595nM波長下的光吸收與蛋白質含量成正比，故可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G－250結合在2Min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速，其結合物在室溫下1H內保持穩定。該反應快速靈敏(靈敏度比ＦolIn－酚法還高4倍)、易于操作、干擾物質少(考馬斯亮藍G－250和蛋白質通過范德華力結合，受蛋白質的特異性影響較小，除組蛋白外，其他不同種類蛋白質染色強度差異不大)，可測定微克級蛋白質含量，是一種比較好的蛋白質定量法。但此方法也存在其缺點，考馬斯亮藍在蛋白質含量很高時線性關系偏低，且不同來源蛋白質與色素結合狀況有差異。
【儀器與用具】
721分光光度計；10Ml量筒1個；研缽；燒杯；量瓶；移液管：1Ml 3支，01Ml 3支；10Ml具塞刻度試管14支。
【試劑】
標準蛋白質溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白質100μg／Ml的標準蛋白溶液;
90％乙醇；
85％磷酸(W／V)；
考馬斯亮藍G－250溶液：稱取100μg考馬斯亮藍G－250，溶于50Ml 90％乙醇中，加入85％的磷酸100Ml，zui后用蒸餾水定容到1000Ml，貯放在棕色瓶中，此溶液在常溫下可放置1個月。
【方法】
1標準曲線(蛋白質含量為0～100μg／Ml)的繪制 取6支具塞試管，按表2－1數據配制含0～100μg／Ml的牛血清蛋白質液各1Ml。
表2－1不同蛋白質含量的牛血清蛋白質液配制表
管號123456蛋白質標準液(ml)00.200.400.600.801.00蒸餾水(ml)1.000.800.600.400.200蛋白質含量(μg)020406080100在每支試管中加入5Ml考馬斯亮藍G－250溶液，蓋塞，反轉混合數次，放置2Min后，用1CM光徑比色杯在595nM下比色。以蛋白質濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標繪制標準曲線。
2.樣品提取液中蛋白質濃度的測定 吸取樣品提取液1.0Ml(樣品提取見LoWry法)，放入具塞試管中(每個樣品設置兩個重復)，加入5Ml考馬斯亮藍G－250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，記錄吸光值，并通過標準曲線查得蛋白質含量。
3結果計算
樣品中蛋白質的含量(Mg／g)＝C×VTV1×FW×1000(2-2)
式中C：查標準曲線值(μg)；VT：提取液總體積(Ml)；
ＦW：樣品鮮重(g)； V1：測定時加樣量(Ml)。
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