胰腺干細胞的制備植入步驟

    1、細胞的制備；細胞的來源：采用流產人胚胎（5-7月胎齡）胰腺組織，于解剖顯微鏡下去除周圍的脂肪和結締組織。輕輕地分離并切碎胰腺，膠原酶370C震胰蕩消化30分鐘，然后加冷牛血清和Hanks液保護細胞并終止消化。此方法不但可以分離外分泌腺，還可以降低免疫原性從而減少免疫排斥反應。1500轉離心10分后棄上清，用生長液保存具有生理功能的細胞備用，達到細胞量再行植入。

　　 2、胰腺干細胞的制備：由于胚胎數量不足，往往不能滿足胰島細胞種植的需要，就須在體外進行擴增，達到種植的細胞量。方法同胰島細胞的制備，在細胞終止消化后靜置10分，棄上清，0。25%*370C消化至細胞懸液，在無糖DMEM培養基（含非必需氨基酸，B27）中培養。兩天后換液加入終濃度為10μg/ml的KGF，1mg/ml的ITS。以后每三天換液一次并改換培養基的成分為葡萄糖濃度為17。8mmol/L，10mmol/L尼可酰氨，2%胎牛血清（誘導）其他營養成分不變，觀察其生長情況并在其6-7天時進行傳代（擴增）。

　　 3、細胞植入：當胰島細胞和胰腺干細胞的數量達到糖尿病人種植時，*行細胞的生理功能鑒定及病毒和細菌培養，排除病毒和污染后再行移植。

　　 ㈠、細胞數量是影響種植成功的關鍵因素，因此每個人種植的數量是不同的，嚴格按每公斤體重6000個胰島當量以上進行植入。

　　 ㈡、細胞的純度，即將培養好的胰腺細胞采用雙硫腙染色以平板計數法結合EIN法對胰島陽性細胞計數，通常細胞純度在80%左右。

　　 ㈢、細胞活性鑒定：采用吖啶橙和碘丙啶對細胞進行染色，吖啶橙染色后在熒光顯微鏡下活細胞呈綠色熒光，死亡的細胞碘丙啶染色結合后發出紅色熒光。細胞染色后活度要達到90%以上。

　　 4、降低免疫原性：防止免疫排斥反應是植入細胞成功的關鍵之一，當細胞在制備中370C消化30分鐘，即可降低其免疫原性；應用免疫抑制劑對防止植入細胞后的急性排斥反應很重要，成人植入后，聯合應用免疫抑制劑包括*A、*、霉酚酸脂、*等。約服用一個月的免疫抑制劑無免疫排斥反應即可停用。5-20歲處在生長發育期慎用或不用，或改用不影響發育的免疫排斥劑。