免疫組化染色基本技術及注意事項

時間：2017/5/18閱讀：532

① 根據課題的內容選用動物，選用配套的Ab。如Ab-I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無交叉，則不能用其他動物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必須來源于鼠，否則不能連接成復合物。

② 若要比較染色深淺在對照組與實驗組間的差異，在貼片方面貼于同一張載片上，否則無可比性。

③ 選用的試劑可靠，貨源充足，隨時可取。

2.Ab稀釋度 (如系購買的藥盒有工作液和原液)

(1)工作液:無須稀釋

(2)原液:

① 應參照其提供的工作液濃度進行預試驗驗。

如:工作液濃度為1∶1000，可選1∶500，1∶1000，1∶1500試驗;

若: 1∶500有背景，1∶1000陽性反應稍淺，可選1∶750進行試驗。

② 原液的保存(-20℃)凍存--應選稀度凍存。

③ 若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍，而后分裝10μl/瓶→凍存(-20 ℃)于冰箱備用。

④ 關于Ab保存應參照說明書。

(3)Ab濃度的選擇

Ab濃度不可太高或太低，因為Ag-Ab結合需在一定濃度范圍內進行，若一方過剩則形成復合物小且少;極過剩時已形成的復合物亦會解體而呈現假陰性。--并非Ab濃度越高越好。

3.Ab滴片技術

-- 進口ELISA試劑盒所滴的抗體應與切片上的組織剛好吻合。

滴抗體前需把切片上的水弄干，但不能干片。

要領:甩凈組織周圍的水。

4.PBS洗滌技術

(1)洗滌的目的

① 保證離子濃度和PH值。

② 減少非特異反應(平時Ab不可靠很純)

(2)方法:洗三次，每次5分鐘。

5.Ab孵育技術

(1)必須在濕盒內進行，以防抗體的蒸發和干片。

(2)溫度與時間 4℃:過夜;

37℃:2 h or 參考說明書

6.進口ELISA試劑盒光鏡控制顯色方法

(1)室內操作:注意溫度與時間的關系，室溫zui宜5分鐘。

(2)染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。

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