量子點(diǎn)的制備及在生命科學(xué)中的應(yīng)用

1、量子點(diǎn)的制備

   量子點(diǎn)自身的優(yōu)點(diǎn)使其相關(guān)的合成方法也顯得尤為重要。量子點(diǎn)的合成研究zui初是為了得到單分散性好的納米粒子,以便對(duì)其量子尺寸效應(yīng)進(jìn)行深入的研究。到目前為止,有關(guān)量子點(diǎn)的合成方法已有很多。然而,根據(jù)所采用原料和工藝的不同,概括起來大致可分為金屬化合物-元素有機(jī)物合成路線和水相無(wú)機(jī)合成路線。

   以CdO取代Cd(CH3)2形成配合物,作為Cd的反應(yīng)前體,得到高質(zhì)量單分散的CdSe。對(duì)合成方法進(jìn)行改進(jìn),選取合適的鎘鹽和磷酸氧化物配體,通過一步法成功得到了1.5~25nm的單分散CdSe。經(jīng)過不斷的改進(jìn),他們發(fā)展的這種合成方法已經(jīng)可以用于商業(yè)化的-VI量子點(diǎn)的合成。

   直接水相合成是量子點(diǎn)制備的另一重要途徑。采用巰基化合物如巰基乙酸、3-巰基丙酸等作為納米粒子的穩(wěn)定劑,巰基通過和粒子表面的鎘原子配位來控制粒子的增長(zhǎng),同時(shí)提供穩(wěn)定的電荷層保證分散體系的穩(wěn)定性,選用不同的巰基化合物可方便地調(diào)節(jié)粒子表面的性質(zhì),得到不同用途的CdTe量子點(diǎn)。此外,巰基在表面鎘原子的配位使CdTe表面形成一層鈍化層,形成自然的核殼結(jié)構(gòu),通過光氧化可以使該結(jié)構(gòu)更完整,從而獲得高的熒光量子產(chǎn)率(室溫量子產(chǎn)率在40%左右)。水相合成有很多優(yōu)點(diǎn):(1)采用水為合成介質(zhì),更接近綠色化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn);(2)普通的鹽為原料,制備成本為有機(jī)法的1/10;(3)合成方法簡(jiǎn)單,無(wú)需特殊的無(wú)氧無(wú)水設(shè)備,一般的合成實(shí)驗(yàn)室能夠制備,且可以批量生產(chǎn);(4)無(wú)需進(jìn)一步的表面親水修飾即可以應(yīng)用于生物熒光探針研究。此外,還有其他一些進(jìn)一步提供量子點(diǎn)性質(zhì)的研究。合金型量子點(diǎn)的合成,這種合金型量子點(diǎn)顯示非線性光學(xué)性質(zhì),發(fā)射波長(zhǎng)高于單獨(dú)的量子點(diǎn),處于近紅外區(qū),具有很高的穿透性,可以作為生物體內(nèi)組織標(biāo)記材料。該類型的量子點(diǎn)更為重要的一個(gè)特性是,在室溫條件下,有著非常窄的發(fā)射光譜,僅為14~18nm,接近單粒子熒光峰的寬度。

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2、量子點(diǎn)在生命科學(xué)中的應(yīng)用

在生命科學(xué)領(lǐng)域,熒光圖像技術(shù)是一種重要的手段,然而由于有機(jī)染料易于淬滅,無(wú)法對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行長(zhǎng)期的追蹤及觀察標(biāo)記物的動(dòng)力學(xué)過程。熒光蛋白的出現(xiàn)可以在一定程度上解決這一問題,但需使用基因工程技術(shù)制備可表達(dá)融合蛋白的質(zhì)粒,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染等一系列操作,不易普及。量子點(diǎn)的出現(xiàn),以其*的優(yōu)點(diǎn),吸引生命科學(xué)家的注意,比較好地解決了上述存在的問題。

1)量子點(diǎn)的生物標(biāo)記

量子點(diǎn)作為一種新型的熒光試劑,*可以取代傳統(tǒng)的有機(jī)染料,其優(yōu)異的熒光性能將為生命科學(xué)技術(shù)帶來新的突破,從而拉開了量子點(diǎn)在生命科學(xué)中應(yīng)用的序幕。用兩種不同大小(2nm和4nm)的二氧化硅包裹的CdSe/CdS量子點(diǎn)作探針,標(biāo)記3T3成纖維細(xì)胞,生物分子通過靜電和氫鍵或配體-受體與量子點(diǎn)表面相互作用而結(jié)合,從而實(shí)現(xiàn)標(biāo)記。發(fā)綠色熒光的量子點(diǎn)結(jié)合到細(xì)胞核,發(fā)紅色熒光的量子點(diǎn)結(jié)合到肌動(dòng)蛋白絲上,同時(shí)在細(xì)胞中觀察到紅色和綠色的熒光(圖3)。用巰基乙酸處理的CdSe/ZnS量子點(diǎn)與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合,通過受體介導(dǎo)發(fā)生內(nèi)吞作用,將量子點(diǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)到 HeLa細(xì)胞中,進(jìn)行HeLa的標(biāo)記,說明連接了熒光量子點(diǎn)的轉(zhuǎn)鐵蛋白仍然具有活性。同時(shí)他們還將CdSe??ZnS量子點(diǎn)與人IgG結(jié)合,再與特異性抗人IgG多克隆抗體孵育后,產(chǎn)生廣泛的凝集反應(yīng),表明量子點(diǎn)標(biāo)記免疫分子后能識(shí)別特異性抗體或抗原用于免疫化學(xué)研究(圖4)。

熒光量子點(diǎn)表面修飾的方法,通過量子點(diǎn)與具有特異性識(shí)別作用的IgG 或親和素連接成了特異性免疫熒光探針,系統(tǒng)地研究了探針在亞細(xì)胞水平上的標(biāo)記效率,高分辨地觀察到了細(xì)胞結(jié)構(gòu)。用熒光量子點(diǎn)標(biāo)記了神經(jīng)細(xì)胞表面的抑制性神經(jīng)傳遞素受體,實(shí)時(shí)觀察了單個(gè)熒光量子點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)情況,實(shí)現(xiàn)了量子點(diǎn)在活細(xì)胞體內(nèi)單分子水平上的標(biāo)記,跟蹤并分析了單個(gè)神經(jīng)傳遞素受體在神經(jīng)細(xì)胞膜上的擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)過程,并用電子顯微鏡成像證實(shí)了這一過程。該方法依靠量子點(diǎn),用熒光成像和電子顯微鏡成像可以同時(shí)獲得瞬時(shí)動(dòng)力學(xué)信息和高分辨細(xì)胞定位信息,為在單分子水平上研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)提供了一個(gè)強(qiáng)有力的手段。

2)量子點(diǎn)在活體成像方面的應(yīng)用

   在量子點(diǎn)生物標(biāo)記應(yīng)用的基礎(chǔ)上,人們開始將量子點(diǎn)應(yīng)用于活體成像。將肽與量子點(diǎn)結(jié)合用于標(biāo)記特定組織部位的內(nèi)皮細(xì)胞受體。通過靜脈注射將連有肽片段的量子點(diǎn)注入到小鼠體內(nèi),可以觀察到量子點(diǎn)在特定的目標(biāo)組織部位聚集,從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)組織的可視化(見圖5)。

磷脂嵌段共聚物囊泡包覆量子點(diǎn)制備得到量子點(diǎn)-囊泡材料。他們將這種量子點(diǎn)-囊泡材料注入到非洲瓜蟾(Xenopus)的單個(gè)早期胚胎內(nèi),觀察胚胎的發(fā)育過程。研究結(jié)果表明當(dāng)熒光量子點(diǎn)注入到雙細(xì)胞胚胎中的一個(gè)細(xì)胞時(shí),量子點(diǎn)自動(dòng)限制在該注入細(xì)胞的子代中。在被注入量子點(diǎn)的細(xì)胞子代胚胎發(fā)育形成分裂球的發(fā)展過程中,量子點(diǎn)仍類似地限制在注入細(xì)胞的子代中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)還表明所制備的量子點(diǎn)-囊泡材料幾乎不存在毒性,胚分胎能正常發(fā)育,從而可以跟蹤觀察細(xì)胞的裂過程和分辨胚胎發(fā)育過程中的世系關(guān)系(見圖6).

3)生物分析監(jiān)測(cè)

    熒光量子點(diǎn)除了應(yīng)用于上述的生物標(biāo)記以及活體成像領(lǐng)域外,在生物分析監(jiān)測(cè)領(lǐng)域也起著不可忽視的作用。將工程重組蛋白質(zhì)通過靜電作用結(jié)合到CdSe/ZnS核殼型熒光量子點(diǎn)上,然后再與抗體相連接,用于熒光免疫分析。使用這種制備的熒光探針,成功地實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄球菌產(chǎn)生的毒素B和2 4 6-三硝*甲苯的節(jié)能型免疫熒光分析。后來該小組又用不同粒徑CdSe/ZnS量子點(diǎn)對(duì)霍亂、蓖麻毒素、類志賀病毒、葡萄菌腸毒素B四種病毒同時(shí)監(jiān)測(cè)。通過熒光波長(zhǎng)和熒光強(qiáng)度可以獲得樣品中的病毒種類和含量,完成對(duì)同一樣品中不同病毒蛋白的同時(shí)監(jiān)測(cè)分析的任務(wù)。

在傳感器方面量子點(diǎn)也有著十分重要的應(yīng)用。化學(xué)傳感器方面,將CdS量子點(diǎn)固定在 薄膜中,發(fā)現(xiàn)許多氣體可以對(duì)這種薄膜發(fā)生快速的響應(yīng),熒光強(qiáng)度可以增強(qiáng)或淬滅,表明基于不同種類和尺寸的量子點(diǎn)的傳感器可以對(duì)多種氣體同時(shí)進(jìn)行快速檢測(cè)。應(yīng)用熒光共振能轉(zhuǎn)移原理(FRET)可以將量子點(diǎn)用于生物傳感器。量子點(diǎn)作為FRET的供體所引起的可以調(diào)節(jié)的發(fā)射譜可以滿足任何受體的需要,其寬的激發(fā)譜便于選擇不直接激發(fā)受體的激發(fā)光。將生物素標(biāo)記的牛血清白蛋白連接到CdSe/ZnS表面,使之特異性地與四甲基羅丹明(TMR)標(biāo)記的親和素作用,觀察到熒光量子點(diǎn)與TMR之間有熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象發(fā)生,導(dǎo)致染料熒光增強(qiáng)。若發(fā)生的是非特異性作用,則不能觀察到染料熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象。該實(shí)驗(yàn)的成功表明,基于量子點(diǎn)的FRET在監(jiān)測(cè)抗原/抗體作用、DNA雜化等方面有著重要的實(shí)際應(yīng)用前景。

量子點(diǎn)另一個(gè)重要的應(yīng)用前景在于將不同數(shù)量、不同熒光發(fā)射色的熒光量子點(diǎn)組合,可以實(shí)現(xiàn)多色編碼技術(shù)。根據(jù)計(jì)算可知,只需5~6種顏色結(jié)合6種發(fā)光強(qiáng)度的熒光量子點(diǎn)進(jìn)行不同組合得到的熒光量子點(diǎn)微粒就可以形成10000~40000個(gè)可以識(shí)別的編碼。如果增加發(fā)光強(qiáng)度的變化到10種,則可以提 供100萬(wàn)個(gè)可以識(shí)別的編碼,理論上就可以對(duì)100萬(wàn)個(gè)不同的DNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼。將不同數(shù)量不同熒光發(fā)射色的熒光量子點(diǎn)組合后裝進(jìn)聚苯乙烯微球中,從而形成具有不同光譜特征和亮度特征的可標(biāo)記到生物大分子上的微粒。在模擬實(shí)驗(yàn)中利用這些制備的微粒在混合的DNA試樣中進(jìn)行檢測(cè),準(zhǔn)備了3種顏色的微粒,并將他們連接到遺傳物質(zhì)的條帶上,每種顏色對(duì)應(yīng)一個(gè)特殊的DNA序列。在已知DNA與用染料標(biāo)記的未知DNA進(jìn)行雜交后,通過染料分子可以判斷出雜交成功與否,通過光譜可以讀出每種熒光量子點(diǎn)的發(fā)光強(qiáng)度的比例關(guān)系,從而可以判斷出所連接的DNA(見圖7)

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