在western blotting 方面，本文是一個(gè)新手，目前正準(zhǔn)備磷酸化蛋白的Western，急需這方面的實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作步驟和一些注意事項(xiàng)的指導(dǎo)。在網(wǎng)絡(luò)上搜集整理了一個(gè)western blot實(shí)驗(yàn)達(dá)人的建議，供大家參考。
我做了很久的western blot，尤其是phospho-抗體，可以算是達(dá)人了。我根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)磷酸化蛋白之western blot提出以下建議，供剛?cè)腴T的同仁參考：
1.一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，否則即使band壓出來(lái)也會(huì)很淺，結(jié)果也不可信。
2.加一抗后4度過(guò)夜，保證抗體有充分的結(jié)合時(shí)間。因?yàn)榱姿峄牡鞍字徽伎偟牡鞍琢康臉O少部分。4度也可使一抗重復(fù)使用多次。畢竟磷酸化的抗體都挺貴的。二抗則室溫1小時(shí)即可。
3.磷酸化抗體的好壞是一個(gè)關(guān)鍵因素，所以要選擇好的廠商。個(gè)人認(rèn)為，Cell signaling公司做的磷酸化抗體不錯(cuò)，尤其是MAPKs磷酸化抗體。
3.根據(jù)廠商的protocol來(lái)操作實(shí)驗(yàn)，這是實(shí)驗(yàn)成功的保證。如Cell signaling會(huì)建議用含5%BSA的TBST稀釋phospho-p38等抗體，效果不錯(cuò)，而不是用常見(jiàn)的含5%non-fat milk的TBST。
4.抗體的稀釋倍數(shù)也要適當(dāng)。不同廠商也會(huì)有不同要求。
5.研究完某一蛋白的磷酸化情況后也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量。如壓完phospho-p38抗體后，我會(huì)把相同的membrane做strip后再壓p38,然后再strip一次，再壓內(nèi)標(biāo)actin。
6.做磷酸化蛋白WB時(shí),除了目標(biāo)蛋白的band以外,往往會(huì)出現(xiàn)非特異性的band.磷酸化抗體不好的話,甚至?xí)撼龇翘禺愋缘腷and,而沒(méi)有你想要的band,所以壓片以后,你一定要根據(jù)markers比對(duì)一下,你壓出的band分子量是否正確.我以前壓WB時(shí),壓出了一條band,就以為是我想要的那條,然后還根據(jù)趨勢(shì)推測(cè)可能的機(jī)制,走了不少怨枉路.還有一次,把markers的分子量記錯(cuò)了,比對(duì)出來(lái)的結(jié)果當(dāng)然也不對(duì).
7.磷酸化蛋白WB時(shí)backgroud也往往較深,所以壓片時(shí)間要適當(dāng),不能太長(zhǎng)或過(guò)短,太長(zhǎng)則backgroud太深蓋住想要的那條band,時(shí)間過(guò)短則可能沒(méi)有band或者band太淺.
8.磷酸化蛋白WB時(shí),用TBST洗時(shí)也要注意一下,搖床的轉(zhuǎn)速不要太快,洗的時(shí)間不要太長(zhǎng),孵育一抗和二抗之后分別洗5min 3次即可,寧愿background深一些,總比做不出來(lái)強(qiáng)得多.另外，洗的時(shí)候，不要把幾張membrane疊在一起洗。
9.下圖列出的是我所用的做磷酸化蛋白western blot的lysis buffer的配方,效果不錯(cuò),供您參考.
10.對(duì)我的lysis buffer配方作以下說(shuō)明:
（1）Na3VO4要活化
（2）我的配方配的是100ml 細(xì)胞裂解液,但如您各個(gè)成分的體積加起來(lái),會(huì)發(fā)現(xiàn)total=102.1ml,那是因?yàn)檫@些成分加在一起后總體積會(huì)縮小的.
11.正如我在第5點(diǎn)所說(shuō)的,"研究完某一蛋白的磷酸化情況后也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量“。這有兩種方法，一是：相同的sample在不同的well中上樣兩次（可在相同的gel上，也可在不同的gel），其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達(dá)量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白），甚至還可跑另一個(gè)gel，壓內(nèi)標(biāo)。但是本人不建議如此做，因?yàn)檫@樣比較時(shí)誤差還是較大的。因此，比較*的，本人也建議如此的方法，即：將原先結(jié)合上的磷酸化抗體及二抗洗去（strip），strip solution如下:
100mM 2-mercaptoethanol （stock 14.335M, 取697.6ul）
2% SDS （stock 10%, 取20ml）
62.5mM Tris （pH6.7）（stock 1M, 取6.25ml）
加水至100ml
然后50度水浴30min.
許多人會(huì)建議55度水浴30min。Strip solution是用來(lái)去除已結(jié)合的抗體，但也會(huì)去除部分的蛋白，導(dǎo)致蛋白信號(hào)變?nèi)酢Ｎ冶救私?jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水浴時(shí)有時(shí)溫度不穩(wěn)定，溫度定為55度時(shí)往往其溫度容易超過(guò)，導(dǎo)致較多的蛋白也被去除，故建議溫度設(shè)為50度30min，既能有效去除已結(jié)合的抗體，又比55度更能保護(hù)蛋白.
12. Strip時(shí)一定要注意：membrane一定要*泡在strip solution中（可用較硬的塑料膜封好），然后要*浸入水中，使受熱均勻。這一點(diǎn)很重要，要不然，隨后壓出來(lái)的總蛋白也好，內(nèi)標(biāo)也好就會(huì)不均一，無(wú)法進(jìn)行比較。我曾將同一張membrane用我提供的方法strip了3次，分別壓不同的抗體（因?yàn)橛袝r(shí)候蛋白分子量很接近），效果都不錯(cuò)。
13. Activation of Sodium OrthoVanadate
（1）. Make Sodium orthovanadate to 200mM in ddH2O.
（2）. Adjust pH to 10.0 with 1M NaOH or 1M HCl （the starting pH varies depending on the lot of the chemical）. At pH 10.0 the solution is yellow.
（3）. Boil the solution until it turns colorless （about 10 mins）.
（4）. Allow solution to cool to room temperature.
（5）. Readjust pH to 10.0 and repeat steps 3 & 4 until the soluition remains colorless and the pH stabilizes at 10.0. Store in aliquots at -20 oC.
NOTE: Activation depolymerizes the vanadate, converting it to a more potent
inhibitor of protein tyrosine phosphatases. See: Gordon J. Methods Enzymol. 1991, 201:477-82.
