1、誘導(dǎo)之后表達(dá)上清中檢測(cè)不到目的蛋白：
分析1：檢測(cè)的方法是否有問(wèn)題，要考慮是不是蛋白表達(dá)量低而沒(méi)有檢測(cè)到?
如果是蛋白表達(dá)低，可以選擇濃縮蛋白，具體的方法很多，有TCA、丙酮、濃縮柱等等方法，之前在本版已經(jīng)發(fā)過(guò)帖，在此不贅述。
2、如果蛋白濃縮N倍之后仍然檢測(cè)不到，那基本可以確證蛋白并不在上清中。那么蛋白到哪里去了，考慮是否沒(méi)有分泌出來(lái)，而是在胞內(nèi)，那就需要通過(guò)裂解酵母來(lái)檢測(cè)胞內(nèi)蛋白，具體的方法很多，在此也不贅述，曾整理過(guò)相關(guān)破碎的帖子。
3、如果胞內(nèi)也沒(méi)有目的蛋白表達(dá)，那么基本可以確定蛋白并沒(méi)有表達(dá)。
4、為什么沒(méi)有表達(dá)呢?倒推回來(lái)就是誘導(dǎo)的過(guò)程了，誘導(dǎo)體系是什么?甲醇濃度是多少?培養(yǎng)問(wèn)題是多少，轉(zhuǎn)速是多少?這些都要注意。甲醇一般是0.5%-1.0%，本人用的是0.5%，也有很多人也用1.0%，曾見(jiàn)過(guò)一個(gè)帖子，說(shuō)超過(guò)1.5%反而會(huì)抑制表達(dá)，沒(méi)有驗(yàn)證過(guò)，供大家參考。培養(yǎng)問(wèn)題28-30度比較合適，轉(zhuǎn)速250rpm比較合適，誘導(dǎo)體系沒(méi)有固定的體系，說(shuō)明書(shū)上的是BMGY到OD600 2~6，換到BMMY中OD600 為1左右。
5、如果誘導(dǎo)的過(guò)程也沒(méi)有問(wèn)題，那問(wèn)題就復(fù)雜了，特別是重組酵母PCR檢測(cè)證明目的基因確實(shí)已經(jīng)發(fā)生了重組。這個(gè)時(shí)候是zui郁悶的了，但是郁悶怎么辦，還是要找原因，在此我給的建議是先做RT-PCR證明mRNA水平的情況，也就是說(shuō)有沒(méi)有轉(zhuǎn)錄。如果轉(zhuǎn)錄了，后續(xù)的操作也沒(méi)有問(wèn)題（本帖的1、2、3、4項(xiàng)），那么只有重新設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，比如換酵母株，有文章上說(shuō)：用GS115表達(dá)不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達(dá)。
6、有個(gè)帖子說(shuō)的很好，在此和大家分享一下。
1、 菌株：用GS115表達(dá)不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達(dá)。
2、溫度： 在28度和室溫下誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)水平可能都不低。
3、pH：手冊(cè)上用6.0，pH提高到6.8，不表達(dá)的蛋白可能就表達(dá)出來(lái)。BMMY的pH7.0-7.5比較合適。國(guó)內(nèi)外做的的rHSA，zui適pH大概5-6左右。pH3的時(shí)候yeast和peptone好像會(huì)沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氫鉀調(diào)，具體比例自己去試試。
4、偏愛(ài)密碼子： codon bias一般不是主要的問(wèn)題，你要表達(dá)的蛋白特性才是主要問(wèn)題，酵母對(duì)分子量大（30KD以上），結(jié)構(gòu)復(fù)雜（如一些蛋白酶），二硫鍵含量多的蛋白往往不能有效表達(dá)，尤其是分泌表達(dá)。密碼子改造對(duì)一些較小的而且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的蛋白表達(dá)量的提高可能有一些作用。比如一位戰(zhàn)友用Pichia酵母表達(dá)一個(gè)單鏈抗體，29KD，含有2對(duì)二硫鍵，表達(dá)量約幾毫克每升，選用酵母偏好密碼子全基因合成后，表達(dá)量沒(méi)有什么提高。
5、表達(dá)時(shí)間與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)照：誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)了以后，是會(huì)有很多蛋白分泌出來(lái)的，時(shí)間越長(zhǎng)雜蛋白就越多，且分子量都比較大。做一個(gè)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對(duì)照，這樣就會(huì)比較肯定到底是不是自身的蛋白分泌的結(jié)果。
6、污染：每個(gè)樣品從G418板上挑10個(gè)左右單克隆于2ml BMGY搖菌（30ml玻璃管，比LB管大一點(diǎn)），紗布一般用8層，一天左右看著比較渾離心，留樣1ml，余1ml換2ml BMMY誘導(dǎo)表達(dá)，3,4層紗布足夠了。
污染一般都是跟瓶口覆蓋有關(guān)的原因造成的，只蓋紗布肯定會(huì)污染。加蓋報(bào)紙后，就再?zèng)]遇到過(guò)污染。如果只用6層紗布，污染的可能當(dāng)然很大，100ml三角瓶，裝量10ml培養(yǎng)液，用橡筋把8層紗布和2層報(bào)紙拴緊封口，空氣浴搖床。
7、不表達(dá)：蛋白有沒(méi)有表達(dá)就要看你的運(yùn)氣了，一般重復(fù)2-3次實(shí)驗(yàn)都沒(méi)有表達(dá)菌株，這個(gè)蛋白就放棄表達(dá)了。
8、表達(dá)量： 30KD,10mg/L表達(dá)量已經(jīng)很高，zui直接的方法是發(fā)酵，一般提高5-10倍。大腸桿菌一樣出現(xiàn)大團(tuán)的超表達(dá)蛋白。
9、糖基化：酵母分泌表達(dá)的N糖基化是可以預(yù)測(cè)的，有如下序列：N X S/T就是潛在的糖基化位點(diǎn)，X為任意氨基酸，1個(gè)糖基化位點(diǎn)會(huì)加上1-3KD左右的糖基。另外可能還有O糖基化話，但是無(wú)法預(yù)測(cè)其位點(diǎn)，不過(guò)很少聽(tīng)說(shuō)表達(dá)蛋白有O糖基化的。如果胞內(nèi)表達(dá)，不存在糖基化的問(wèn)題。
10、表型與表達(dá)：重組SalI和BglII酶切產(chǎn)生單交換和雙交換，結(jié)果就是產(chǎn)生Mut+和Muts表型的菌株;前者在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)生長(zhǎng)快，消耗的甲醇多，后者生長(zhǎng)慢，消耗的甲醇少，所以誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)Muts表型要求更高的菌體濃度。一般用Mut+表型的較多，但是對(duì)某些蛋白Muts菌株可能表達(dá)的更好，只有試試才知道你的蛋白用那種菌株表達(dá)較好。
11、培養(yǎng)基
YPD：zui基本的培養(yǎng)用;BMGY：誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)用;BMMY：誘導(dǎo)表達(dá)用;MD：電轉(zhuǎn)化后篩選his+用。
YEPD是不能代替BMGY的，因?yàn)橛衅咸烟牵@樣殘留的葡萄糖會(huì)影響下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。不過(guò)有一種方法是可行的，就是用YPG培養(yǎng)基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發(fā)酵罐比，油殘余會(huì)抑制甲醇利用。
BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、。配制BMMY時(shí)也沒(méi)必要用5%過(guò)濾除菌的甲醇，在滅菌后使用前加甲醇至你要的濃度。
YNB可以高壓滅菌，沒(méi)問(wèn)題的，也可以0.22um過(guò)濾處理，天冬氨酸和要待培養(yǎng)基高壓滅菌后加入;配YPD時(shí)可以加入YPD一起滅菌，但時(shí)間不能太長(zhǎng)，溫度不能太高，一般121-125度12-15分鐘足夠了。若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溫度過(guò)高，可能導(dǎo)致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，這是配制培養(yǎng)基中的禁忌。顏色很深的話，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培養(yǎng)基108度35min高壓滅菌。
小量發(fā)酵其實(shí)可以把培養(yǎng)基成分中的YNB和去除，培養(yǎng)基價(jià)格便宜，操作又方便，可以直接滅菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。
如果是用自己配置的培養(yǎng)基，如玉米浸提液、麥芽浸提液、麥麩浸提液等等，可以不用換液，采取添料來(lái)維持酵母對(duì)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)需要。
用無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，更省錢(qián)。
