士鋒生物醋酸纖維膜電泳操作方法

時(shí)間：2013/9/11閱讀：764

醋酸纖維膜電泳是一項(xiàng)簡便而又迅速的方法。它的優(yōu)點(diǎn)是：①電泳區(qū)帶分離清楚，比瓊脂平板電泳分辨率高;②可以定量;③樣品用量少，只需要幾微升即可。

（一）材料與試劑

1.pH8.6離子強(qiáng)度0.05緩沖液

2.0.5%氨基黑染色液

3.透明液：冰醋酸 3 份 ;95%乙醇 2 份混合即可

4.醋酸纖維膜

（二）操作方法

1.將醋酸纖維膜條浸于緩沖液中，浸透后用竹鑷子夾到濾紙上，吸去過多的水分。將膜的光滑面向下搭在電泳槽兩側(cè)的濾紙橋上，注意搭平。

2.加樣用微量加樣器于負(fù)1.5cm處加樣1µl～3µl，注意樣品要成一條直線且垂直方向。也可用血球計(jì)數(shù)板蓋玻片蘸取樣品輕輕點(diǎn)上。

3.電泳電壓10V/cm～15V/cm或0.4mA/cm～0.6mA/cm電泳45min～60min，至電泳區(qū)帶展開約2.5cm～3.5cm時(shí)，關(guān)閉電源。

4.染色將膜浸于氨基黑染色液中，染色數(shù)分鐘。

5.透明將染色的醋酸纖維膜浸于透明液中，漂洗5min ~10min，至背景呈乳白色為止。為了防止膜上出現(xiàn)許多氣泡，可以逐漸升高透明液濃度10%、20%以至30%。

6.結(jié)果觀察及保存透明后，將膜貼于玻璃上，干后取下，即可觀察結(jié)果并保存。

7.定量將各區(qū)帶剪下，分別浸于4Mol/L NaOH 4ml中，振搖數(shù)次，約2h，色澤被浸出，于580nm～620nm比色，測出各區(qū)帶的OD值。同時(shí)剪一塊大小相似無蛋白的透明膜同樣處理，做為對照。

計(jì)算各區(qū)帶蛋白含量百分比（以血清為例）

總OD值T=A α1 α2 β γ

白蛋白%=A/T×

以此類推。

（三）注意事項(xiàng)

1.醋酸纖維膜孔隙小，含水量少，且較薄，因此它對熱很敏感，故應(yīng)注意控制電壓、電流。

2.樣品不可過多，只需幾微升即可。

3.加樣一定要呈直線、垂直、分布均勻，這樣泳動的區(qū)帶整齊、不歪。

4.注意醋酸纖維膜的質(zhì)量，浸泡很久仍有大塊白色硬點(diǎn)者可棄之不用。

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