二步法：EnVision System
EnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體（即 EnVision）直接放大信號40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。特點：敏感、省時、方便、背景低（避免了內(nèi)源性干擾）。
EnVision工作程序：
1） 脫蠟、水化組織切片。
2） 預(yù)處理組織切片（據(jù)一抗具體說明而定）
3） 蒸餾水漂洗，置于TBS中。
4） 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（僅用于EnVisionTM/HRP）
5） 蒸餾水漂洗，置于TBS，10分鐘
6） 一抗孵育10-30分鐘
7） TBS漂洗10分鐘
8） EnVisionTM孵育10-30分鐘
9） TBS漂洗10分鐘
10) 色源底物溶液孵育10分鐘
11) 蒸餾水漂洗
12) 復(fù)染及封片
免疫染色方法
The basic principles of ICC
• 抗原抗體反應(yīng)
• 標(biāo)記化學(xué)反應(yīng)
• 呈色化學(xué)反應(yīng)
要求
待檢標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)
和抗原性保存良好,
抗原不從原位擴散
或丟失
Specimen preparation
取材新鮮，固定及時，形態(tài)保存完好，抗原物質(zhì)的抗原性不丟失、不擴散和被破壞
• Fixation
• Sample Type
Cryostat (frozen) sections
Paraffin Sections
Antigen Retrieval Techniques
• Intention: To facilitate the immunological reaction of antibodies with antigens (increase reactivity of the majority of antigens) .
Antibody Staining
• Primary antibody may be directly labeled
• labeled secondary antibody or more complex detection system.
• secondary antibody against the immunoglobulins of the primary antibody source
減少或消除非特異性染色的方法
• zui常見原因 蛋白吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上