堿裂解法大量提取質粒DNA（同時純化）

時間：2016-5-4閱讀：917

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準備工作：
細菌培養：小量提取質粒dna鑒定正確后，將菌液以1/50~1/20體積的比例接種到250ml液體培養基中，37℃振蕩培養過夜至對數生長晚期。
注：培養體積與zui終質粒DNA的收獲量并無線性關系。只要培養條件適宜，50ml的培養液有時也可得到總量高達1mg以上的質粒。

操作步驟：
1、細菌的收獲：將菌液倒入合適的離心管中，8000g離心5分鐘，棄上清，并在吸水紙上倒置離心管使上清全部流盡。

2、將細菌沉淀重懸于10ml溶液Ｉ中。
溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)
注：（1）若溶液Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ配制時間過久，可加入少量；（2）由于沉淀的影響，懸液的體積會達到11~13ml。

3、加15ml溶液Ⅱ，顛倒混勻。
溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS

4、加12ml溶液Ⅲ，輕微振蕩混勻。
溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸鉀60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml

5、12000g離心5分種，棄沉淀。將上清轉移到另一離心管中。

6、加入60%體積的異丙醇，顛倒混勻后，室溫靜置5分鐘。12000g離心５分鐘，棄上清。

7、沉淀溶解于4~6mlTE中，加入1/50體積RNaseA貯存液，顛倒混勻，37℃靜置10分鐘。

8、加入1/2體積的Tris飽和酚、1/2體積的氯仿-異戊醇(24:1)混合液，劇烈振蕩混勻。

9、4℃12000g離心30秒，將上層液體與少量下層液體轉移到另一離心管后，再12000g離心5分種，小心吸取上層液體。

10、加入等體積13％聚乙二醇(PEG8000)-1.6mol/LNaCl混合液，顛倒混勻，冰上靜置0.5~2小時。

11、4℃12000g離心10分種，棄上清，DNA沉淀用70%乙醇洗滌。

12、沉淀干燥后，溶解于適量高壓滅菌的水中。
注：（1）溶解體積一般為0.2~1ml；（2）此時得到的是已經純化的質粒DNA，可直接進行各種酶學操作。

13、取樣品進行電泳或紫外定量。

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