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上海瑞齊生物科技有限公司作者
細胞低溫凍存是培養室常規工作和通用技術。細胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。
1． 凍存細胞
（1）選對數增生期細胞（證明無支原體污染），在凍存前1d換液。
（2）按常規方法把培養細胞制備成懸液，計數，使細胞密度達5×107／ml左右密度，離心，去上清。
（3）加入配制好的凍存液（培養液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養液中加入保護劑10％二甲基亞砜（DMSO） 或甘油，可使冰點降低，使細胞內水分在凍結前透出細胞外。
（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m懸液。
（5）旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標記。
（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min時間內，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促進冰晶形成。
操作時應戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷。
2. 復蘇細胞
（1）從罐中取出凍存管。
（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成。
（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養液。
（4）低速離心（500～1000r／min） 5min，去上清后再用培養液洗一次。
（5）用培養液適當稀釋后，裝入培養瓶37℃培養，次日更換一次培養液后，繼續培養。以后仍按常規進行培養。
凍存細胞數量要充分，密度應達到107／ml，在融后稀釋20倍時，仍能保持5×105／ml數量。
關鍵詞：通用技術
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