線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書

【資料簡(jiǎn)介】

線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書                                                                          分光光度法  25 管/12 樣 
正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定 
測(cè)定意義 
線粒體復(fù)合體Ⅴ又稱F1F0-ATP合酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，
由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成，也可逆過
程水解ATP。此外，復(fù)合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養(yǎng)菌和光合細(xì)菌中。復(fù)合體Ⅴ是線粒體氧
化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。 
線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書 測(cè)定原理 
復(fù)合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生 ADP和 Pi，通過測(cè)定 Pi增加速率來測(cè)定復(fù)合體Ⅴ活性。 
需自備的儀器和用品 
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸
餾水。 
試劑的組成和配制 
試劑一：25mL×1瓶，-20℃保存； 
試劑二：25mL×1瓶，-20℃保存； 
試劑三：1 mL×1瓶，-20℃保存； 
試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前每支加入 1.3mL蒸餾水，充分溶解備用，用不完的
試劑仍-20℃保存; 
試劑五：6mL×1 瓶，4℃保存； 
試劑六：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 3mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；  
試劑七：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；  
試劑八：粉劑×1 瓶, 4℃保存；臨用前加入 10mL蒸餾水，充分混勻；溶解后4℃保存一周；  
試劑九：液體10mL×1 瓶，室溫保存。 
線粒體復(fù)合體Ⅴ試劑盒說明書 定磷試劑的配制：按 H2O:  試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)
為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請(qǐng)根據(jù)需要，用多少配多少） 。 
注意：配試劑用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。  
樣本的前處理： 
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離： 
①   準(zhǔn)確稱取 0.1g組織或收集 500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞，加入 1mL試劑一和 10uL 試劑三，用冰
浴勻漿器或研缽勻漿。 
②   將勻漿 600g，4℃離心5min。 
③   棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。 
④   上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅴ（此步可選
做） 。 
⑤   步驟④中的沉淀即為線粒體，加入 800uL試劑二和 8uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，
功率 20％或200W，超聲 3s，間隔 10秒，重復(fù) 30 次），用于復(fù)合體Ⅴ酶活性測(cè)定。 
 
測(cè)定步驟 
1、酶促反應(yīng) 
試劑名稱（μL）  對(duì)照管  測(cè)定管 
試劑四  25  25 
試劑五  100  100 
  樣本      125 
混勻，  37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確水浴 30min 
試劑六  50  50 
樣本    125   
混勻，4000g，25℃離心10min，取上清液 
2、定磷 
上清液  170  170 
定磷試劑  830  830 
混勻，室溫靜置 10min左右，在 660nm處讀取 A測(cè)定管和 A對(duì)照管，計(jì)算 ΔA=A測(cè)定管-A
對(duì)照管。 
復(fù)合體Ⅴ活性計(jì)算 
標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y = 1.274x + 0.004；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L），y為 A值。 
1、組織中復(fù)合體Ⅴ活性的計(jì)算: 
（1）  按樣本蛋白濃度計(jì)算 
單位的定義：每 mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。 
  復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106
]÷(V樣×Cpr) ÷T 
                                                  =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr 
此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。 
（2）  按樣本鮮重計(jì)算 
單位的定義：每 g組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol  無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。 
  復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min /g 鮮重） =[(ΔA-0.004) ÷1.274×V反總×106
]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T 
=50.7× (ΔA-0.004) ÷W 
（3）  按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 
單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol  無(wú)機(jī)磷定義為一個(gè)酶活性單位。 
復(fù)合體Ⅴ活性（nmol/min  /104
  cell）=[(ΔA-0.004)  ÷1.274×V 反總×106
]÷(500×V 樣÷V 樣總) 
÷T=0.101× (ΔA-0.004)   
V反總：反應(yīng)體系總體積，3×10-4
 L；  V樣：加入樣本體積，0.125 mL；V樣總：加入提取
液體積，0.808 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，
g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。