酶聯免疫試劑盒的反應

【資料簡介】

1、儀器設備

酶聯免疫檢測儀（Bio－550）；酶標板 （96孔）；微量注射器。

2、試劑

 （1）HRP標記羊抗兔Ig G（1:1 000，國產）；標準牛IgG；兔抗牛血清（1:256）；

 （2）包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4℃，保存, Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g,蒸餾水稀釋至100 mL。 

（3）稀釋液與洗滌液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃，保存。NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween—20，0.5mＬ。蒸餾水加至1000mＬ。

（4）封閉液：含0.1%明膠0.01mol/L PBS， pH7.4。

（5）鄰苯二胺底物溶液（臨用前配制）：臨用前將Na2HPO4·12H2O 2.9g,檸檬酸0.51g溶于100mL蒸餾水中, 再加入40mgOPD，40μL30%H2O2。

（6）終止液：2mol/LH2SO4。于500mL蒸餾水中加入98%濃硫酸76mL混均即可。

3、操作方法

 （1）將抗原結合在酶標板上。取標準IgG（10mg/mL）用碳酸鹽緩沖溶液稀釋，得到濃度為0.1μg/mL的包被液，每孔加人100μL抗原包被液，并以不加標準抗原的兩孔為對照，為反應的0%值，將反應板于4℃放置一夜（8個樣品，分3個平行，4個100%值孔；共28+2孔）。

（2）標準牛IgG與初級抗體一兔抗牛血清的反應。將標準IgG（10mg/mL）用稀釋液作二倍稀釋得到一系列不同濃度的標準牛IgG（4μg/mL至0.325μg/mL）各200μL，加到入32倍稀釋好的200μL的兔抗牛血清中，其中4個不加標準牛IgG作為測量時的100%值。4℃反應放置一夜。

（3）封閉板。將包被好的酶標板孔內液體傾去，進行洗滌，各孔加200μL洗滌液后室溫下放置1min，倒掉，如此重復4次后，在吸水紙上拍干，加封閉液進行封閉，在37℃放置45min（注意：空白孔也要加封閉液）。封閉后，如前述洗滌。

（4）向酶標板中加人標準抗原和抗體的混合物。將標準牛IgG和兔抗牛血清的混合物取100μL加入到酶標板孔內，同是4個未加抗原的100%值的平行樣也加入酶標板中。37℃放置2h，再洗板4次。

（5）加人HRP標記的羊抗兔Ig G。洗滌后每孔加100μL稀釋好的HRP-羊抗兔IgG，37℃放置1h，洗滌。

（6）加人OPD底物。洗板4次后，每孔加人100μL底物溶液，于37℃暗處反應20min后，每孔加人50μL結束反應液以終止反應。

（7）吸收測定。用酶聯免疫檢測儀測定波長為492nm下的吸光值。

（8）數據處理。標準曲線是以Ig（標準牛IgG含量）對B/Bo作圖，求得線性方程。其中，C為標準牛IgG含量；B為不同濃度標準牛IgG吸收值與0%吸收值之差;Bo為100吸收值與0%吸收值之差。