小鼠腹腔巨噬細胞原代培養實驗

【資料簡介】

實驗方法原理 
巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養，難以長期生存。
實驗材料 小鼠
試劑、試劑盒 RPMI1640培養基酚紅酒精小牛血清巰基乙醇酸鈉雙抗培養液小牛血清青霉素鏈霉素臺盼蘭酒
儀器、耗材 綿球手術直剪注射器培養皿超凈臺解剖板眼科剪離心管眼科鑷
實驗步驟 
一、實驗材料準備
 
1.   動物：各個品系的小鼠2-4只。
 
2.  試劑：RPMI1640培養基(含酚紅)，小牛血清，雙抗，培養液(10%小牛血清、RPMI1640、雙抗)，臺盼蘭等。酒綿球和酒精綿球。
 
3.  器械：一次性注射器、手術器械。
 
二、實驗方法
 
如果采用刺激物，則可在實驗前三天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉每只2 mL，獲得的巨噬細胞數要多一些。不采用刺激物，直接開始下面的步驟。
 
1.  拉頸處死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分鐘，移入超凈臺中，仰臥位固定于解剖板上，酒消毒腹部皮膚，酒精綿球脫。用手術直剪充分剪開腹部皮膚，暴露腹部肌層，再用酒精綿球消毒腹部肌層。
 
2.   用注射器抽取5 mL含雙抗的RPMI1640培養基注入腹腔，用綿球輕揉腹部1-2 min，然后，用眼科鑷稍提起腹腔，并用眼科剪剪開一個小口，用吸管吸取細胞懸液，移入離心管中(個人認為，此法比用注射器抽吸好一些)。
 
3.  1 000 rpm離心5 min后，用含雙抗的RPMI1640培養基洗滌一次，再次離心，重懸細胞于含10%小牛血清的RPMI1640培養液中，如果是作為飼養細胞使用，則選擇相應的培養液。臺盼藍拒染法計數，將細胞稀釋到目的濃度后，接種即可。
 
4.  如果是作為飼養細胞使用，調整濃度至2x105個/mL，接種到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作為其它實驗使用，可以調整成2x106/mL，加到24孔平底培養板中，1 mL/孔；5% CO2溫箱孵育2 h后，換液，并用RPMI1640培養基洗1-2次，棄去未粘附細胞，貼壁細胞為單層的巨噬細胞。
 
三、 結果
 
巨噬細胞剛貼壁時偏圓形，或者類似鵝卵石形狀，然后慢慢伸出偽足，鋪開呈三角形或多角形。巨噬細胞有吞噬的特性，當與細菌混合在一起的時候，在40倍物鏡下可以看到巨噬細胞吞噬細菌，因此，巨噬細胞作為飼養細胞可以清除部分污染的細菌、支原體和部分細胞碎片。
 
 
收起
注意事項 
1.  巨噬細胞是終末分化細胞，不會增殖。

2.  很難消化下來，所以接種的時候，必須直接接種到目的培養器皿中。
 
3.  嚴格無菌操作，在超凈臺內進行。

4.  為避免交叉感染，每一只小鼠更換注射器。

5.  吸管吸取細胞懸液的時候，盡量不要吸到大小腸，否則容易引起成纖維細胞污染。
收起
其他 
巨噬細胞剛貼壁時偏圓形，或者類似鵝卵石形狀，然后慢慢伸出偽足，鋪開呈三角形或多角形。巨噬細胞有吞噬的特性，當與細菌混合在一起的時候，在40倍物鏡下可以看到巨噬細胞吞噬細菌，因此，巨噬細胞作為飼養細胞可以清除部分污染的細菌、支原體和部分細胞碎片。