【中國環(huán)保在線 技術(shù)前沿】在冬季低溫影響下，污水處理廠氮污染物去除效果也容易出現(xiàn)反復(fù)。硫自養(yǎng)反硝化法以運(yùn)行成本低、效率高、工藝簡(jiǎn)單等特性受關(guān)注，尤其是在低溫低碳氮比條件下的應(yīng)用更是突出。本文以顆粒硫磺和黃鐵礦的硫自養(yǎng)反硝化反應(yīng)器為研究對(duì)象，進(jìn)行詳細(xì)數(shù)據(jù)記錄。

污水低溫脫氮：硫自養(yǎng)反硝化法效果顯著

 

　　由于冬季低溫的影響，中國北方污水處理廠常面臨季節(jié)性TN超標(biāo)的問題。此外，受制于市政污水低碳氮比的水質(zhì)特性，污水處理廠也面臨著異養(yǎng)反硝化不充分而導(dǎo)致的TN超標(biāo)問題。與異養(yǎng)反硝化相比，硫自養(yǎng)反硝化是以還原態(tài)硫?yàn)殡娮庸w，NO3--N為電子受體進(jìn)行的自養(yǎng)反硝化過程，能夠有效地去除水中的NO3--N.硫自養(yǎng)反硝化因無需外加碳源、運(yùn)行成本低、污泥產(chǎn)量少、效率高、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛關(guān)注。目前，Li等將硫自養(yǎng)反硝化工藝應(yīng)用于低溫、低碳氮比條件下污水處理廠氮污染物的去除，并達(dá)到了90%以上的氮去除效果。另一方面，硫自養(yǎng)反硝化過程作為冬季或低碳比條件下的脫氮保障工藝，常面臨季節(jié)性、間歇性運(yùn)行的操作方式。但是針對(duì)硫自養(yǎng)反硝化工藝饑餓忍耐后能力恢復(fù)及其對(duì)微生物菌群結(jié)構(gòu)影響的研究卻鮮見報(bào)道。
 

　　近年來，分子生物學(xué)作為有效手段用來研究污水處理過程中微生物群落結(jié)構(gòu)特性，如變形梯度凝膠電泳、克隆文庫和高通量測(cè)序等。MiSeq高通量測(cè)序以Illumina的測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，通過可逆終止試劑方法對(duì)數(shù)百萬個(gè)基因片段同時(shí)進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序，具有分析結(jié)果、高速等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于污水處理過程中微生物結(jié)構(gòu)和多樣性研究。
 

　　本文以顆粒硫磺和黃鐵礦的硫自養(yǎng)反硝化反應(yīng)器為研究對(duì)象，探究反應(yīng)器在經(jīng)過30 d饑餓忍耐后的恢復(fù)情況，并利用MiSeq高通量測(cè)序?qū)︷囸I忍耐前后反應(yīng)器中細(xì)菌群落的變化情況進(jìn)行分析，以期為污水處理廠脫氮保障工藝的季節(jié)性、間歇性運(yùn)行提供技術(shù)參考。
 

　　1 材料與方法
 

　　1.1試驗(yàn)裝置
 

　　硫自養(yǎng)反硝化工藝采用降流式生物濾池，試驗(yàn)裝置示意圖如圖 1所示。反應(yīng)器為密封的有機(jī)玻璃柱，內(nèi)徑140 mm，高度1 170 mm，填充高度500 mm，有效容積5.94 L.進(jìn)水口距柱底600 mm，沿反應(yīng)器不同高度處分別設(shè)置取填料口，取填料口距填料頂部的距離分別是100 mm和300 mm。

　　圖 1 試驗(yàn)裝置示意

 

　　試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)反應(yīng)器(分別記為1號(hào)、2號(hào))，1號(hào)反應(yīng)器加入硫磺和白云石的混合物，2號(hào)反應(yīng)器加入黃鐵礦和白云石的混合物。 2個(gè)反應(yīng)器中的填料均按1:1的體積比混合裝填，硫磺、黃鐵礦和白云石的粒徑均為5——10 mm.其中，硫磺/白云石的填充區(qū)域孔隙率為45.9%，黃鐵礦/白云石為44.1%。
 

　　1.2 進(jìn)水水質(zhì)和接種污泥
 

　　本試驗(yàn)用水為人工模擬污水廠尾水，水質(zhì)指標(biāo)為： NO3--N濃度為30 mg˙L-1，NH4+-N濃度為2 mg˙L-1，TP濃度為1 mg˙L-1，COD濃度為18——23 mg˙L-1，pH為6.8——7.2.接種污泥取自高碑店污水處理廠二沉池回流污泥。
 

　　1.3 反應(yīng)器運(yùn)行方式
 

　　反應(yīng)器在低溫下運(yùn)行85 d (1月2日至3月26日)，主要分為穩(wěn)定期、饑餓期和恢復(fù)期：穩(wěn)定期(1——30 d)，正常進(jìn)水，反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行，平均溫度為12℃；饑餓期(31——60 d)，停止進(jìn)水，反應(yīng)器處于饑餓狀態(tài)，平均溫度12.8℃；恢復(fù)期(61——85 d)，恢復(fù)進(jìn)水，反應(yīng)器進(jìn)入恢復(fù)期，平均溫度為14℃。饑餓期結(jié)束后及恢復(fù)期采集反應(yīng)器中的污泥樣品(1號(hào)饑餓期A1、恢復(fù)期A2；2號(hào)饑餓期B1、恢復(fù)期B2) 進(jìn)行MiSeq高通量測(cè)序分析，分析反應(yīng)器饑餓期及穩(wěn)定期細(xì)菌群落的變化情況。
 

　　1.4 測(cè)試指標(biāo)和方法1.4.1 水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定
 

　　反應(yīng)器運(yùn)行期間，定期采樣進(jìn)行水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定，檢測(cè)項(xiàng)目包括硝酸鹽氮(NO3--N)、亞硝氮(NO2--N)、總氮(TN)、總磷(TP) 等。其中NO3--N采用紫外分光光度法測(cè)定；NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測(cè)定；TN采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測(cè)定；TP采用鉬酸鹽分光光度測(cè)定。試驗(yàn)所用分光光度計(jì)為HACH DR5000紫外可見分光光度計(jì)。生物量采用脂磷法測(cè)定。
 

　　1.4.2 微生物多樣性的測(cè)定
 

　　DNA的提取與PCR的擴(kuò)增：為了探究系統(tǒng)的細(xì)菌群落，在反應(yīng)的饑餓期和恢復(fù)期進(jìn)行取樣。采用E. Z. N. A. Soil DNA試劑盒(美國Omega公司)，按照試劑盒說明書提供的操作步驟提取。提取的DNA用1%瓊脂凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。 PCR的擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S rRNA的V3-V4區(qū)，細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增引物采用通用引物(338F/806R)。引物名稱和引物序列分別是338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) 和806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。 PCR反應(yīng)體系： Forward primer (10 μmol˙L-1)，2 μL；Reverse primer (10 μmol˙L-1)，2 μL；dNTPs (2.5 mmol˙L-1)，4 μL；10×PCR buffer，5 μL；Pyrobest DNA Polymerase (2.5 U˙μL-1)，0.3 μL；補(bǔ)充ddH2O至50 μL.反應(yīng)程序：先95℃預(yù)熱5 min；然后進(jìn)行25個(gè)循環(huán)(95℃變形30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s)，后72℃延伸10 min.用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司) 回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)Tris-HCl洗脫后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。根據(jù)電泳結(jié)果。將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM -ST (Promega公司) 進(jìn)行定量，按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。
 

　　MiSeq文庫構(gòu)建與測(cè)序：用高通量測(cè)序平臺(tái)Illumina MiSeq對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行MiSeq高通量測(cè)序。測(cè)序得到的PE reads根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)過濾掉低質(zhì)量的reads，區(qū)別樣品后進(jìn)行OUT聚類分析和物種分類學(xué)分析。
 

　　生物多樣性和分類學(xué)分析：首先將序列按照彼此的相似性歸為操作分類單元(OTU)。按照97%相似性進(jìn)行OUT聚類，采用RDP classifier對(duì)97%相似水平的OUT代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。利用MOTHUR軟件對(duì)樣品覆蓋率(coverage percentage)，ACE，Chao豐富指數(shù)以及Shannon多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。同時(shí)為了保證分析的高可信度，根據(jù)SILVA106庫中的參考序列對(duì)OUT進(jìn)行種屬鑒定，種屬比對(duì)的可信度閾值設(shè)定為80%.
 

　　2 結(jié)果與討論
 

　　2.1反應(yīng)器運(yùn)行情況
 

　　穩(wěn)定期、饑餓期和恢復(fù)期的硫自養(yǎng)1號(hào)和2號(hào)反應(yīng)器進(jìn)出水水質(zhì)的變化情況如圖 2所示。進(jìn)水NO3--N、NO2--N、TN和TP平均濃度分別為30.00、0.01、35.88和1.00 mg˙L-1.穩(wěn)定期，反應(yīng)器在低溫下(12℃) 運(yùn)行30 d后，1號(hào)反應(yīng)器出水NO3--N、NO2--N、TN和TP濃度分別為1.78、0.03、2.87和0.91 mg˙L-1，TN去除率為91.9%，1號(hào)反應(yīng)器具有較高的脫氮效果。 2號(hào)反應(yīng)器出水NO3--N、NO2--N、TN和TP濃度分別為11.32、0.11、13.10和0.14 mg˙L-1，TN和TP去除率分別為63.49%和86.41%. 2號(hào)反應(yīng)器具有同步脫氮除磷的效果。

　　圖 2 饑餓前后反應(yīng)器NO3--N、NO2--N、TN、TP的變化

 

　　反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行后，停止進(jìn)水，進(jìn)入饑餓期。經(jīng)過30 d的饑餓忍耐后，反應(yīng)器在低溫下(14℃) 恢復(fù)進(jìn)水，進(jìn)入恢復(fù)期。由圖 2可以看出，饑餓忍耐后，1號(hào)反應(yīng)器出水NO3--N增加到27.87 mg˙L-1，2號(hào)反應(yīng)器出水NO3--N增加到26.56 mg˙L-1.但隨著反應(yīng)器的恢復(fù)，出水NO3--N濃度逐漸降低，1號(hào)反應(yīng)器經(jīng)5 d的恢復(fù)(第65 d)，出水NO3--N和TN濃度分別為0.38 mg˙L-1和2.37 mg˙L-1，去除率分別為98.8%和93.6%；2號(hào)反應(yīng)器經(jīng)11 d的恢復(fù)(第71 d)，出水NO3--N和TN濃度分別為10.51 mg˙L-1和12.91 mg˙L-1，去除率為66.40%和65.57%.其次，在恢復(fù)期2個(gè)反應(yīng)器的出水NO2--N濃度均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，恢復(fù)初期均出現(xiàn)NO2--N的積累。由圖 2可知，1號(hào)反應(yīng)器恢復(fù)期第3 d (第63 d) 出水NO2--N濃度為2.17 mg˙L-1；2號(hào)反應(yīng)器恢復(fù)期第5 d(第65 d)，出水NO2--N濃度為0.37 mg˙L-1.隨著反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行，終1號(hào)反應(yīng)器NO2--N濃度下降到0.1 mg˙L-1以下，2號(hào)反應(yīng)器有0.1 mg˙L-1 NO2--N的積累量。此外，饑餓忍耐未對(duì)2號(hào)反應(yīng)器TP的去除效果產(chǎn)生明顯的影響。原因如下，2號(hào)反應(yīng)器對(duì)磷的去除主要是通過黃鐵礦中的鐵與磷結(jié)合形成鐵磷沉淀物及鐵的氧化物和氫氧化物對(duì)磷有吸附作用，饑餓條件下并未明顯影響這一物理化學(xué)過程。結(jié)果表明，與1號(hào)反應(yīng)器相比，2號(hào)反應(yīng)器的恢復(fù)時(shí)間略長(zhǎng)，但2個(gè)反應(yīng)器都能在低溫、短期內(nèi)恢復(fù)到正常處理效果。
 

　　饑餓期(第60 d) 及恢復(fù)期(第85 d) 反應(yīng)器不同高度處微生物量的變化如表 1所示。從中可知，1號(hào)和2號(hào)反應(yīng)器饑餓忍耐后不同高度處微生物量均低于恢復(fù)期。分析原因，主要是饑餓期間反應(yīng)器中部分微生物對(duì)饑餓環(huán)境的忍耐能力差，裂解死亡；部分細(xì)菌因營養(yǎng)物質(zhì)缺乏而進(jìn)入休眠狀態(tài)，不能進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。反應(yīng)器恢復(fù)進(jìn)水后，生物膜的活性和生長(zhǎng)可得到不同程度的恢復(fù)，使得微生物量有所增加，同時(shí)反硝化性能得以恢復(fù)。

　　表 1 饑餓忍耐前后反應(yīng)器不同高度處生物量的變化/nmol˙g